迷失岛2的二周目玩法是游戏的核心内容之一，与一周目相比增加了更多解谜要素和隐藏成就。开启二周目的方法是在一周目通关后返回主菜单，选择新游戏并确认擦除游戏记录。二周目保留了部分一周目的玩法框架，但新增了六个三角形石块、两间密室以及关键道具铁锥等元素，这些内容必须完成一周目后才能解锁。二周目的主要目标是收集六个三角形石块，用于开启神庙密室，同时解开金字塔密室和工厂铁箱的谜题，最终揭示游戏的隐藏真相。
二周目的关键步骤之一是开启神庙密室。首先需要在灯塔二层左侧找到六个三角形石块的分布图，随后按照图中提示的位置收集所有石块。这些石块分别位于桥梁起始点、工厂章鱼怪附近、神庙石室内部、飞船二楼密码箱、船舱底层以及金字塔旁的石碑处。收集完成后，将石块按照分布图的顺序镶嵌在神庙二楼的石门上，即可打开密室。密室内的壁画是后续解谜的重要线索，需要仔细观察并记录图案特征。
工厂铁箱的解谜是二周目的另一核心环节。铁箱位于工厂大厅左侧，需要将金字塔门口获得的红色块放入铁箱中心的凹槽，激活周围的眼睛图案。根据神庙密室壁画上眼睛的睁开状态（中间及第3、5、7、8只眼睛），点亮对应的眼睛即可打开铁箱，获得关键道具铁锥。铁锥需带回神庙密室，放入通电后的装置中，与NPC对话后可获得金字塔密室的密码4325。这一密码对应密室内钢管的长度顺序，输入后触发最终剧情。
金字塔密室的华容道谜题是二周目的最终挑战。解开华容道后进入密室，按照NPC提供的密码调整钢管长度，激活时空门并点击海怪的眼睛，即可完成二周目全部剧情。通关后仍可继续探索隐藏成就，例如回灯塔二层获取船票并寄出以解锁邮递员成就。
